摘要

在過去二十年中，生物制藥在改善各種癌癥、自身免疫、遺傳疾病等患者的生活質(zhì)量方面取得了突破性進(jìn)展。隨著生物制藥需求的不斷增長(zhǎng)，在不影響產(chǎn)品安全性、質(zhì)量和功效的前提下，降低制造成本至關(guān)重要，越來(lái)越多的生物制品以凍干粉針的劑型被不斷研究出來(lái)并應(yīng)用于臨床。雖然冷凍干燥技術(shù)應(yīng)用于生物制品具有許多優(yōu)勢(shì)，但同時(shí)生物制品在冷凍干燥的過程中也容易發(fā)生蛋白聚集或變性導(dǎo)致藥物效價(jià)降低。在技術(shù)上為了降低冷凍干燥對(duì)生物制品的不良影響，往往采用添加輔料或者優(yōu)化凍干工藝這兩種方法。本文綜述了可提高生物制品穩(wěn)定性，應(yīng)對(duì)或降低生物制品變性的冷凍干燥技術(shù)以及一些新型凍干技術(shù)最新研究進(jìn)展。

冷凍干燥的原理及過程

冷凍干燥技術(shù)是將液態(tài)的藥液降溫凍結(jié)成固體，然后在真空環(huán)境下進(jìn)行升華干燥以除去冰晶，升華結(jié)束后同樣于真空環(huán)境下進(jìn)行解析干燥以除去結(jié)合水[1]。針對(duì)藥物采用凍干工藝其能夠保留原有的理化性質(zhì)、生理活性，降低藥物有效成分損失，并且凍干藥物制劑通常具有多孔和疏松結(jié)構(gòu)，能夠使藥物快速恢復(fù)其活性以及水分。凍干制劑含有較低水量，利于長(zhǎng)期保存，因此藥物凍干工藝是藥物干燥的有效方法。藥物冷凍干燥的過程主要分為4個(gè)步驟：預(yù)凍、升華干燥（一次干燥）、解析干燥（二次干燥）、密封保存。在藥物凍干過程中應(yīng)滿足以下條件：第一，藥物固化溫度低于其共晶點(diǎn)；第二，升華干燥溫度應(yīng)低于其崩解溫度；第三，解析干燥溫度應(yīng)低于其玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度Tg。依照上述步驟凍干后的藥品可以室溫或冷藏進(jìn)行長(zhǎng)期儲(chǔ)存，需要使用的時(shí)候，添加合適的溶劑復(fù)溶后，便可恢復(fù)到凍干前的狀態(tài)。

改善凍干生物制品變性降解的措施

生物制品在上述冷凍干燥及保存的過程中都有變性的可能[3]。為應(yīng)對(duì)或減少生物制品在凍干過程及長(zhǎng)期保存中的變性，通常會(huì)采用兩種方式，即在處方中添加保護(hù)劑和優(yōu)化凍干工藝。

1.添加保護(hù)劑

凍干保護(hù)劑是凍干制劑中的一種添加劑，能夠減少或阻止冷凍干燥過程對(duì)蛋白造成的變性影響。根據(jù)凍干冷凍過程和干燥過程對(duì)蛋白質(zhì)施加應(yīng)力的不同，將蛋白質(zhì)保護(hù)劑的作用機(jī)制分為冷凍保護(hù)機(jī)制和干燥保護(hù)機(jī)制。保護(hù)劑的種類很多，主要包括糖類、多元醇類、氨基酸類、高分子類、表面活性劑等。實(shí)際工作中通常根據(jù)生物制品的凍干變性特性添加一種或多種保護(hù)劑。

2.優(yōu)化凍干工藝

通過優(yōu)化凍干工藝，生物類制品在凍干過程及保存期間的穩(wěn)定性同樣也能夠得到一定的改善。主要可優(yōu)化的步驟為預(yù)凍、一次干燥（升華干燥）、二次干燥（解析干燥）。預(yù)凍的工藝優(yōu)化——控制冰晶大小根據(jù)生物制品的變性機(jī)制，在預(yù)凍過程中控制冰晶的大小是改善生物制品穩(wěn)定性的主要方法之一。Geidobler等[5]通過控制冰晶大小的不同制備了牛血清白蛋白和某單克隆抗體的凍干制劑并比較其穩(wěn)定性。發(fā)現(xiàn)通過快速冷凍即預(yù)先冷凍隔板的方法制備過程中冰晶較小，一次干燥時(shí)間較長(zhǎng)，同時(shí)制備的凍干粉比表面積較大。一次干燥——改變干燥溫度，一次干燥是整個(gè)冷凍干燥過程中耗時(shí)最長(zhǎng)的步驟，同時(shí)也是最復(fù)雜的步驟。一次干燥理想的狀態(tài)為在合理的溫度下讓其盡快升溫至平衡溫度，且盡可能地縮短平衡溫度時(shí)間。二次干燥——控制升溫速率，二次干燥是冷凍干燥的最后一個(gè)階段。據(jù)Tang[6]研究表明，這種慢速的升溫方式是對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量較為安全的。這一升溫速率同樣適用于生物制品。

生物制品的創(chuàng)新凍干技術(shù)

批量冷凍干燥是制造固體生物制藥的主要商業(yè)手段。然而，冷凍干燥是一種經(jīng)濟(jì)上不友好的生產(chǎn)方式，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，能耗高，資本投資大，導(dǎo)致總體成本高。本文綜述了一些潛在的創(chuàng)新干燥技術(shù)。雖然在生物制藥行業(yè)尚未得到廣泛接受，但一些潛在的連續(xù)干燥技術(shù)為研究開辟了道路，以應(yīng)對(duì)與傳統(tǒng)冷凍干燥技術(shù)相關(guān)的挑戰(zhàn)。本綜述包括一些創(chuàng)新的干燥技術(shù)，即旋轉(zhuǎn)冷凍干燥、懸浮小瓶的連續(xù)冷凍干燥、主動(dòng)冷凍干燥、噴霧冷凍和動(dòng)態(tài)冷凍干燥、Lynfinity 技術(shù)、噴霧干燥、PRINT 技術(shù)和生物制藥的MicroglassificationTM，以及選擇干燥工藝的一些考慮因素[7]。

1.常規(guī)批次冷凍干燥（Conventional Batch Freeze-drying）

傳統(tǒng)的分批冷凍干燥分批冷凍干燥過程涉及根據(jù)升華原理從溶液中去除溶劑，通常是水。典型的間歇式冷凍干燥機(jī)由一個(gè)帶多個(gè)貨架的干燥室、一個(gè)冷凝器和一個(gè)真空泵組成。冷凍干燥過程包括三個(gè)主要步驟：冷凍、一次干燥和二次干燥，見圖1。

（圖來(lái)源于https://www.lyophilizationworld.com/post/2020/03/19/thelyophilization-process.）

圖1. 常規(guī)間歇冷凍干燥流程

2.單位劑量的旋轉(zhuǎn)冷凍干燥（Spin-freeze-drying of Unit doses）

1957年，Becker首次獲得旋轉(zhuǎn)冷凍法專利，專利號(hào)DE967120。該方法隨后被用于冷凍干燥，并于1965年獲得Broadwin的專利，專利號(hào)為US3203108A，Oughton等人于1999年獲得了US5964043的專利。通過對(duì)專利和傳統(tǒng)冷凍干燥工藝的修改，作者發(fā)明了一種新的單位劑量連續(xù)冷凍干燥工藝。這種連續(xù)冷凍干燥技術(shù)的一個(gè)主要特點(diǎn)是含有目標(biāo)液體產(chǎn)品的小瓶沿其縱軸旋轉(zhuǎn)，因此，這被稱為旋轉(zhuǎn)冷凍干燥，見圖2。

（圖來(lái)源于De Meyer et al.，2017；https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2017.09.004.）

圖2. 旋轉(zhuǎn)冷凍干燥工藝

該過程從連續(xù)旋轉(zhuǎn)冷凍步驟開始，其中含有液體產(chǎn)品的小瓶沿縱軸快速旋轉(zhuǎn)一段時(shí)間，通常為2500–3000 rpm。軸向旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致在小瓶?jī)?nèi)壁形成分散層，相對(duì)均勻的厚度為1 mm。隨后，將旋轉(zhuǎn)瓶暴露于溫度受控的無(wú)菌低溫氣體流中，如氮?dú)饣蚨趸?。由于冷凍產(chǎn)品遍布小瓶?jī)?nèi)壁，這導(dǎo)致了較大的表面積，從而允許快速均勻地冷凍/加熱分散層。凝固過程大約需要1-2分鐘，產(chǎn)品的溫度通常在-40 ~60 C之間再持續(xù)10-20分鐘。為了實(shí)現(xiàn)賦形劑的結(jié)晶和所需的形態(tài)，進(jìn)一步修改溫度控制室中的冷卻工藝條件。冷卻步驟完成后，小瓶通過傳送帶系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到主干燥室。每個(gè)小瓶都保存在具有所需壓力和溫度條件的腔室中的導(dǎo)熱套或口袋中。護(hù)套環(huán)繞小瓶的外表面，以促進(jìn)通過傳導(dǎo)或輻射均勻分布熱量。隨后，將小瓶轉(zhuǎn)移至二級(jí)干燥室以解吸殘余水。圖3描繪了連續(xù)干燥系統(tǒng)的示意圖。干燥步驟持續(xù)約30分鐘至2小時(shí)。據(jù)報(bào)道，根據(jù)小瓶尺寸和產(chǎn)品配方，總加工時(shí)間減少了10-40倍。

圖3. 連續(xù)旋轉(zhuǎn)冷凍干燥系統(tǒng)示意圖

總之，這種連續(xù)冷凍干燥的概念在減少干燥時(shí)間、連續(xù)吞吐量和所有單個(gè)小瓶的PAT方面具有更大的優(yōu)勢(shì)，但是，需要解決在cGMP環(huán)境中建立這種連續(xù)過程的可行性，以及相關(guān)的放大和驗(yàn)證過程。

3. 懸浮小瓶的連續(xù)冷凍干燥

最近，根據(jù)專利PCT編號(hào)WO2018204484，開發(fā)了一種稱為懸浮小瓶連續(xù)冷凍干燥的新概念。如圖4所示，冷凍干燥裝置由用于不同單元操作的一系列模塊組成，這些模塊連接在一起，以確保小瓶的連續(xù)流動(dòng)。小瓶懸掛在具有多排的軌道上，允許小瓶通過具有不同溫度和壓力條件的腔室轉(zhuǎn)移。每個(gè)腔室由負(fù)載鎖定系統(tǒng)隔開，該系統(tǒng)有助于在不同模塊之間轉(zhuǎn)移小瓶。當(dāng)這些小瓶不斷裝入冷凍干燥機(jī)時(shí)，它們被填滿并部分塞住。灌裝后，小瓶進(jìn)入冷凍區(qū)，通過真空誘導(dǎo)表面冷凍技術(shù)（VISF）通過自發(fā)成核或控制成核進(jìn)行冷凍。凍結(jié)過程中的傳熱是通過強(qiáng)制空氣對(duì)流或輻射冷卻氣體來(lái)實(shí)現(xiàn)的。產(chǎn)品內(nèi)溫度梯度的顯著降低導(dǎo)致通過懸浮小瓶結(jié)構(gòu)形成更大且均勻的孔隙。這進(jìn)一步導(dǎo)致升華速度更快，因此，與傳統(tǒng)冷凍干燥相比，縮短了總干燥時(shí)間。此外，受控成核減少了小瓶之間冰晶的不均勻性，從而在小瓶之間形成均勻的多孔結(jié)構(gòu)。

（圖來(lái)源于https://doi.org/10.1021/acs.iecr.8b02886）

圖4. 懸浮小瓶的連續(xù)冷凍干燥

4.主動(dòng)冷凍干燥（Active-freeze-drying）

與托盤式散裝冷凍干燥相比，Hosowaka Micron B.V.根據(jù)專利號(hào)EP1601919A2開發(fā)了攪拌式散裝冷凍干燥，稱為“主動(dòng)冷凍干燥”。主動(dòng)冷凍干燥工藝允許以最小的處理量干燥熱敏性散裝材料，從溶液、懸浮液和糊狀物到濕固體。與凍干蛋糕不同，最終的干燥產(chǎn)品是以自由流動(dòng)的粉末形式獲得的。另一個(gè)特點(diǎn)是，通過攪拌可以改善某些產(chǎn)品的特性。此外，可以實(shí)現(xiàn)更高的傳熱速率和縮短干燥時(shí)間。工藝流程包括夾套錐形真空干燥器、葉輪、收集過濾器、產(chǎn)品收集器、冷凝器和真空泵，如圖5所示。

圖5. 主動(dòng)冷凍干燥過程的示意圖

5.噴霧冷凍和動(dòng)態(tài)冷凍干燥技術(shù)

Meridion Technologies根據(jù)賽諾菲巴斯德公司的兩項(xiàng)專利開發(fā)了SprayCon Lab 噴霧冷凍干燥機(jī)，專利號(hào)為US10006706B2和US9347707B2。圖6顯示了生產(chǎn)規(guī)模的噴霧冷凍干燥工藝和由Meridion Technologies生產(chǎn)的噴霧冷凍干燥微球的示意圖。輸送液體容器和噴霧冷凍室位于旋轉(zhuǎn)冷凍干燥機(jī)上方，通過一根冷卻管和一個(gè)將兩個(gè)工藝區(qū)域緊密分隔的活門連接。干燥后的產(chǎn)品通過輸送管從干燥室輸送到填充容器中。除上述創(chuàng)新的凍干技術(shù)，還包括IMA Life連續(xù)無(wú)菌噴霧冷凍干燥技術(shù)、噴霧干燥等新型凍干技術(shù)。

圖6. Meridion Technologies噴霧冷凍干燥過程示意圖和噴霧冷凍干燥微球

總結(jié)

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，凍干技術(shù)在生物制藥行業(yè)的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，應(yīng)用該技術(shù)的同時(shí)需要根據(jù)不同的生物制品特性加入一些保護(hù)劑或者是優(yōu)化凍干工藝以穩(wěn)定其制品。伴隨著凍干保護(hù)機(jī)制的研究逐步深入，凍干技術(shù)也在不斷的完善和進(jìn)步。但是對(duì)于生物制品例如蛋白的表征還需要更加深入的認(rèn)知，穩(wěn)定性機(jī)制還有待進(jìn)一步深化。而對(duì)凍干工藝過程中的某些參數(shù)，比如壓力、復(fù)溶后產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)表征和性質(zhì)是否發(fā)生改變等報(bào)道甚微，還需要更深一步的了解。盡管面對(duì)諸多問題，但是凍干技術(shù)仍是保持生物制品穩(wěn)定性的最有效方法。而開發(fā)更加優(yōu)越的凍干保護(hù)劑，提高生物產(chǎn)品的質(zhì)量是凍干技術(shù)的研究熱點(diǎn)。

目前，批量冷凍干燥是大多數(shù)生物制藥產(chǎn)品成熟的干燥技術(shù)。許多替代干燥技術(shù)在不影響生物制藥產(chǎn)品的安全性、質(zhì)量和功效的前提下，越來(lái)越顯示出制造固體生物制藥的前景。這些潛在的干燥技術(shù)對(duì)生物制藥行業(yè)具有重要意義，因?yàn)樗鼈儾粌H可以減少制造救命藥物的時(shí)間、能源消耗和相關(guān)成本，而且有助于降低在新冠肺炎等流行病期間藥物供應(yīng)的任何風(fēng)險(xiǎn)。雖然一些替代方法以較低的運(yùn)營(yíng)成本提供連續(xù)制造，但溫度、剪切等CPP對(duì)產(chǎn)品CQA的影響是選擇干燥技術(shù)的基本要求。雖然干燥技術(shù)，即旋轉(zhuǎn)冷凍干燥、噴霧冷凍干燥、噴霧干燥、PRINT 和MicroglassificationTM對(duì)某些蛋白質(zhì)和吸入生物制藥的穩(wěn)定性有積極的影響，但它們對(duì)廣泛的腸外生物制藥的影響尚待研究。通過特定產(chǎn)品的研究，需要有足夠的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，才能從傳統(tǒng)的冷凍干燥轉(zhuǎn)變?yōu)檫B續(xù)生產(chǎn)。與CPP一樣，選擇干燥過程中的配方成分以及產(chǎn)品對(duì)于確保產(chǎn)品穩(wěn)定性至關(guān)重要。此外，生物制藥與固態(tài)特定賦形劑相互作用的分子機(jī)制尚不清楚。一些先進(jìn)的表征技術(shù)和PAT串聯(lián)可以在理解和評(píng)估產(chǎn)品-過程關(guān)系方面提供更快和深入的分析。雖然大多數(shù)替代干燥方法可以通過使用PAT提供顯著的好處，但其商業(yè)規(guī)模的可行性需要進(jìn)一步探索。在放大、包裝和驗(yàn)證方面，一些替代干燥工藝在降低與多個(gè)填充飾面單元操作驗(yàn)證相關(guān)的復(fù)雜性方面具有更大的優(yōu)勢(shì)。一些替代干燥技術(shù)的商業(yè)規(guī)模操作已被證明在生物制藥行業(yè)具有潛力，但一些規(guī)?；魬?zhàn)尚待解決。

由于凍干是一個(gè)冗長(zhǎng)嚴(yán)苛的脫水過程，優(yōu)化凍干曲線、縮短凍干時(shí)間、保持藥物穩(wěn)定性是對(duì)制劑從業(yè)人員的一個(gè)極大挑戰(zhàn)。

康日百奧生物科技（蘇州）有限公司凍干制劑無(wú)菌灌裝團(tuán)隊(duì)經(jīng)驗(yàn)豐富，作為一家專業(yè)的生物大分子CDMO服務(wù)商，康日百奧生物科技（蘇州）有限公司無(wú)菌制劑灌裝生產(chǎn)車間,包括D級(jí)區(qū)、C級(jí)區(qū)和B級(jí)區(qū)以及B+A環(huán)境下的無(wú)菌灌裝區(qū)域，所有質(zhì)量體系已通過歐盟質(zhì)量受權(quán)人審計(jì)（QP審計(jì)）以及FDA第三方審計(jì)，并已取得藥品生產(chǎn)許可證。在產(chǎn)能方面，康日百奧擁有西林瓶、凍干、預(yù)充針制劑灌裝生產(chǎn)線，灌裝年產(chǎn)量1500萬(wàn)/年。在設(shè)施方面，康日百奧采用智能機(jī)器人無(wú)菌預(yù)灌封系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了灌裝的高精度以及穩(wěn)定的無(wú)菌保障。

關(guān)于康日百奧液體及凍干無(wú)菌灌裝生產(chǎn)線的優(yōu)勢(shì)

商業(yè)化西林瓶?jī)龈删€

可以為（2R,6R,8R,10R,15R,20R,50R）規(guī)格的水針、凍干制劑提供高效的灌裝服務(wù)；

8針頭灌裝，灌裝精度可以穩(wěn)定控制在 1%；

單次批量最大：100,000瓶，年水針產(chǎn)量可達(dá)400萬(wàn)瓶；配置有全自動(dòng)進(jìn)出料系統(tǒng)凍干產(chǎn)能可達(dá)100萬(wàn)瓶/年。

無(wú)菌預(yù)充針、卡式瓶灌裝線

可實(shí)現(xiàn)0.2mL-5.0mL不同制劑規(guī)格高效切換及連續(xù)生產(chǎn)；

康日百奧引入了智能化的無(wú)菌預(yù)灌封系統(tǒng)，借助2個(gè)超潔凈無(wú)菌機(jī)器人手臂，完全實(shí)現(xiàn)了灌裝的高精度，提供了穩(wěn)定的無(wú)菌保障，年產(chǎn)能為1000萬(wàn)支。

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